Isolation and Identification of Polyhydroxyalkanoate (PHA) Producing Bacteria from Food Industrial Wastewater by Using Fluorometric Screening

Abstract

การคัดเลือกเชื้อแบคทีเรียที่สามารถผลิตสารโพลีไฮดรอกซีอัลคาโนเอต (Polyhydroxyalkanote; PHA) จากน้ำทิ้งโรงงานอุตสาหกรรมโดยใช้เทคนิคการย้อมด้วยสารเรืองแสง Nile blue A สามารถแยกเชื้อแบคทีเรียได้ทั้งสิ้น 16 ไอโซเลต จากการจัดจำแนกสายพันธุ์แบคทีเรียด้วยการศึกษาข้อมูลลำดับนิวคลีโอไทด์บริเวณ 16S rDNA ร่วมกับการศึกษาความสัมพันธ์ทางลำดับวิวัฒนาการ พบว่าเชื้อแบคทีเรียที่สามารถจัดจำแนกได้เป็น 5 สกุล ประกอบด้วย Bacillus, Enterobacter, Klebsiella, Asaia, และ Herbaspirillum นอกจากนี้ผลการจัดจำแนกสายพันธุ์แบคทีเรียไอโซเลต OST-B2 และ OST-RA9 มีความใกล้เคียงกับสายพันธุ์ Asaia bogorensis และ Herbaspirillum huttiense ซึ่งยังไม่พบรายงานการผลิต PHA จากแบคทีเรียทั้งสองสายพันธุ์จึงสามารถสรุปได้ว่า OST-B2 และ OST-RA9 เป็นแบคทีเรียสายพันธุ์ใหม่ที่พบการสะสม PHA ภายในเซลล์ นอกจากนี้ยังได้มีการศึกษาความสามารถในการสะสม PHA ภายในเซลล์แบคทีเรียที่คัดเลือกได้ทั้ง 16 ไอโซเลต ภายใต้สภาวะการเพาะเลี้ยงที่ 24, 48, และ 72 ชั่วโมง โดยวิเคราะห์การวัดค่าการดูดกลืนแสงฟลูออเรสเซนจากการติดสีย้อม Nile red ของ PHA แกรนูลภายในเซลล์ พบว่าแบคทีเรียไอโซเลต OST-RA9 สามารถสะสม PHA มากที่สุดโดยเฉพาะที่ 72 ชั่วโมงของการเพาะเลี้ยง ในขณะที่ไอโซเลตอื่นๆมีการสะสมสูงสุดในช่วง 48 ชั่วโมง และจากผลการจัดจำแนกสายพันธุ์แบคทีเรียร่วมกับการศึกษาความสามารถในการสะสม PHA ภายในเซลล์ จึงทำให้ไอโซเลต OST-RA9 เป็นสายพันธุ์ที่น่าสนใจในการศึกษารูปแบบการสร้างและสะสม PHA ภายในเซลล์โดยการศึกษาภายใต้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนชนิดส่องผ่านพบว่าเชื้อแบคทีเรียสามารถสะสม PHA ในลักษณะแกรนูลภายในเซลล์ ซึ่งผลจากการศึกษาในครั้งนี้ทำให้ได้ทราบถึงเชื้อแบคทีเรียชนิดใหม่ๆที่สามารถผลิต PHA ได้ และสามารถนำไปสู่การศึกษาแหล่งวัตถุดิบราคาถูกรวมทั้งการพัฒนาสายพันธุ์แบคทีเรียในการผลิต PHA ให้มีปริมาณสูงต่อไป

The sixteen polyhydroxyalkanoate (PHA) producing bacteria were isolated from industrial wastewater using Nile blue A fluorescence staining technique. The derived PHA-producing strains were identified through the 16S rDNA sequencing analysis and even phylogenetic evaluation. The results revealed that they were belonging to the five bacterial genera including Bacillus, Enterobacter, Klebsiella, Asaia, and Herbaspirillum. Moreover, the genetically identification profile of the two isolates OST-B2 and OST-RA9 were subsequently related to the strain Asaia bogorensis and Herbaspirillum huttiense which has not been proposed as the non-PHA accumulation strains before; hence, they might be classified as the novel PHA producing isolates. Additionally, the intracellular PHA concentration was determined after 24, 48, and 72 h cultivation through the spectrofluorometric technique. As follow, the PHA accumulation profile of OST-RA9 was slightly increased according to the extended cultivation time and maximize production at 72 h cultivation while another bacterial isolates gave the highest PHA production at reach 48 h. Thus, the isolated OST-RA9 could be considered as the attractive PHA producing strain through the highest PHA existence along with its identification appearance. Moreover, the distribution of intracellular PHA granules was subsequently explored in the isolate OST-RA9 according to the electron micrograph observation. Hence, the result would be exhibited a considerable activation of PHA production in different sources through the providing of the most appropriate and inexpensive precursor as well as strain improvement to further maximize the PHA yield.